第三章
高效液相色谱分析
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基本要点： 第一节 高效液相色谱法的特点一、概述 液相色谱法是指流动相为液体的技术。早期的液相色谱（经典液相色谱）是将小体积的试液注入色谱柱上部，然后用洗脱液（流动相）洗脱。这种经典色谱法，流动相依靠自身的重力穿过色谱柱，柱效差(固定相颗粒不能太小)，分离时间很长。 70年代初期发展起来的高效液相色谱法，克服了经典液相色谱法柱效低，分离时间很长的缺点。成为一种高效、快速的分离技术。高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9´107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 二、特点
1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。 第二节 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素一、液相色谱速率理论—影响色谱峰扩展因素 1. 涡流扩散项He A = 2λdp 其含义与其相色谱法相同。 2．纵向扩散项Hd Hd=CdDm/u ( 注：对GC: B/u = 2γDg/u) 式中Cd为常数。由于分子在液相中扩散系数比气相中要小得多，一般小4~5个数量级。故在液相色谱中，此项可以忽略不计。 3．传质阻力项 可分为固定相传质阻力项Hs和流动相传质阻力项。 a. 固定相传质阻力项Hs Hs=CsDf2u/Ds 式中：Cs为与k有关的常数，Df固定液的液膜厚度，Ds试样分子在固定液中的扩散系数。它与 气相色谱法中传质阻力项的含义相同。 b. 流动相传质阻力项： i.流动的流动相传质阻力项Hm： 当试样分子随流动相进入色谱柱时，靠近固定相颗粒的分子流速较慢一些，中央的分子流速较快一些，从而引起色谱峰型扩张。 Hm=Cmdp2u/Dm 式中：Cm为与k有关的函数，dp固定相颗粒直径，Dm组分在流动性中的扩散系数。 ii. 流动相传质阻力项Hsm： 由于固定相是多孔的，部分流动相分子可能进入固定相的微孔中而滞留固定相中的某一局部，滞留在固定相微孔中这部分流动相一般是停滞不流动的。流动相中的试样分子要与固定相进行质量交换，必须先自流动相扩散到滞留区。因此，固定相的颗粒体积越大，微孔越深，传质速度越慢，峰型扩张越严重。 Hs=Csmdpu/Dm 式中：Csm为一常数，dp固定相颗粒直径，Dm组分在流动性中的扩散系数。要降低Hsm，应采用颗粒小，微孔浅，孔 径大的固定相。 综上所述，柱内各种因素引起的塔板高度H为： H= 2λdp+ CdDm/u +( CsDf2/Ds + Cmdp2/Dm + Csmdp/Dm) 可简写为： H=A+B/u+Cu 上式与气相色谱的速率方程在形式上是一致的，其主要区别在于纵向扩散相可以忽略不计。 提高柱效的途径：减小填料粒度以加快传质速率；提高柱内填料装填的均匀性。 二、影响分离的因素——流速 由图3-1知，液相色谱H-u曲线与其
气相色谱不同，是一段斜率不大的直线，
第三节 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型： 1 ．液 — 液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：
式中，cs—溶质在固定相中浓度；cm--溶质在流动相中的浓度； Vs—固定相的体积；Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留 值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。 a. 正相液 — 液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。 b. 反相液 — 液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。 c. 液 — 液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上述缺点。现在应用很广泛（70~80%）。 2 ．液 — 固色谱法 流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下： Xm + nSa ====== Xa + nSm 式中：Xm--流动相中的溶质分子；Sa--固定相中的溶剂分子；Xa--固定相中的溶质分子；Sm--流动相中的溶剂分子。 当吸附竞争反应达平衡时： K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa] 式中：K为吸附平衡常数。[讨论：K越大，保留值越大。] 3 ．离子交换色谱法(Ion-exchange Chromatography) IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。 以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下： X-(溶剂中) + (树脂-R4N+Cl-)=== (树脂-R4N+ X-) + Cl- (溶剂中) 当交换达平衡时： KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-] 分配系数为： DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-] [讨论：DX与保留值的关系] 凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。 4 ．离子对色谱法(Ion Pair Chromatography) 离子对色谱法是将一种 ( 或多种 ) 与溶质分子电荷相反的离子 ( 称为对离子或反离子 ) 加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用下式表示： X+水相 + Y-水相 === X+Y-有机相 式中：X+水相--流动相中待分离的有机离子（也可是阳离子）；Y-水相--流动相中带相反电荷的 离子对（如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等）；X+Y---形成的 离子对化合物。 当达平衡时： KXY = [X+Y-]有机相/[ X+]水相[Y-]水相 根据定义，分配系数为： DX= [X+Y-]有机相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相 [讨论：DX与保留值的关系] 离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。 5 ．离子色谱法(Ion Chromatography) 用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。 以阴离子交换树脂（R-OH）作固定相，分离阴离子（如Br-）为例。当待测阴离子Br-随流动相（NaOH）进入色谱柱时，发生如下交换反应（洗脱反应为交换反应的逆过程）：
抑制柱上发生的反应： R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br- 可见，通过抑制柱将洗脱液转变成了电导值很小的水，消除了本底电导的影响；试样阴离子Br-则被转化成了相应的酸H+Br-，可用电导法灵敏的检测。 离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。也可用于阳离子分析。
6 ．空间排阻色谱法(Steric Exclusion Chromatography) 空间排阻色谱法以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。 第四节 液相色谱法固定相上节讲了高效液相色谱法的主要类型及其分离原理，本节介绍一下各种类型液相色谱所用的固定相。
一、液—液色谱法及离子对色谱法固定相 1．担体 所用的担体可分为如下几类： (1) 全多孔型担体： a. HPLC早期使用的担体与GC类似，是颗粒均匀的多孔球体，如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的Φ»100 μm全多孔型担体。其缺点是：填料的不规则性和较宽的粒度范围会导致填充不易均匀，柱效低；填料孔径分布不一，并存在“裂隙”在填料深孔中形成滞留液体（液坑），溶质分子在深孔中扩散和传质慢，使色谱峰变宽，柱效下降。 b. HPLC在20世纪70年代初开始使用Φ〈10 μm全多孔型担体，它是由nm级的硅胶微粒堆积而成Φ为5 μm或稍大的全多孔小球。其优点是：颗粒小而均匀，传质快（距离短），柱效高。
(2) 表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）： 它是直径为 30 ～ 40 μm 的实心核 ( 玻璃微珠 ) ，表层上附有一层厚度约为 1～ 2μm 多孔表面 ( 多孔硅胶 ) 。 其优点是：孔穴浅（固定相仅为表面的一薄层），传质速度快，易于填充均匀，柱效高。其缺点是：柱子容量低、需要配用高灵敏检测器。 这种担体目前应用较为普遍。 2．固定液 液—液色谱流动相和固定相都是液体，因此要求两相要互不相 溶。在液-液色谱中常用的固定也只有极性不同的几种，如β，β'-氧二丙腈、聚已二醇-400和角鲨烷等。 3．化学键合固定相： 将固定液机械的涂在担体表面上构成的这种固定相，在实际使用时存在不少缺点，20世纪60年末发展起来了一种新型的固定相---化学键合固定相。 即用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担体表面。根据在硅胶表面 (具有≡Si－OH基团) 的化学反应不同，键合固定相可分为：硅氧碳键型 ( ≡ Si－O－C ) ；硅氧硅碳键型 (≡Si－O－Si－C ) 硅碳键型（≡Si－C）和硅氮键型（≡Si－N）四种类型。
化学键合固定相具有如下一些特点：
ⅰ .
表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多；
二、液－固吸附色谱法固定相
采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等，仍可分为全多孔性和薄壳型两种，其特点如前所述。 三、离子交换色谱法固定相 1.薄膜型离子交换树脂: 即以薄壳玻璃珠为担体，在它的表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。 2. 离子交换键合固定相: 用化学反应将离子交换基团键合在惰性担体（如微粒硅胶）表面。 树脂类别：（1） 阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）；（2） 阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）。 四、排阻色谱法固定相 1. 软质凝胶：如交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，适用于水为流动相，在常压下使用。 2. 半硬质凝胶：如苯乙烯－二乙烯基苯交联共聚凝胶（交联聚苯乙烯凝胶），是应用最多的有机凝胶，适用于非极性有机溶剂。 3. 硬质凝胶：如多孔硅胶、多孔玻璃等，多孔硅胶是用得较多的无机凝胶。 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。 近年来发展起来的可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。用它固定相，色谱柱易填充均匀；柱压、流动相流速、pH值或离子强度对分离的影响小，适用于较高流速下操作。
第五节 液相色谱法流动相在气相色谱中，载气是惰性的（与组分分子之间的作用力可忽略不计），常用的只有三四种，他们的性质差异也不大，所以要提高柱子的选择性，只要选择合适的固定相即可。但在液相色谱中，当固定相选定后，流动相的种类、配比能显著的影响分离效果，因此，流动相的选择也非常重要。 选择流动相（又称为：淋洗液，洗脱剂）时应注意下列几个因素。 (1) 流动相纯度：防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 (2) 避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如在液-液色谱中，流动相应与固定液互不相 溶，否则，会使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 (3) 对试样要有适宜的溶解度：试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。 (4) 溶剂的粘度小些为好：否则，会降低试样组分的扩散系数，造成传质速率缓慢，柱效下降。 (5) 应与检测器相匹配：例如，当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。例如，采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)。 除此之外，在选择溶剂时，溶剂的极性是最重要的依据，有时还需要采用二元或多元组合溶剂作为流动相，以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。选择时要参阅有关手册，并通过实验确定。
第 六 节 高效液相色谱仪HPLC的出现不过三十多年的时间，但这种分离分析技术的发展十分迅猛，目前应用也十分广泛。其仪器结构和流程也多种多样。典型的高效液相色谱仪结构和流程可用下列方框图表示（See Fig.3-4）。高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。
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．高压泵 HPLC使用的高压泵应满足下列条件： a. 流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围（一般为1~10 mL/min）； b. 能抗溶剂腐蚀； c. 有较高的输液压力；对一般分离，60×105Pa的压力就满足了，对高效分离，要求达到150~300×105Pa。
(1). 往复式柱塞泵
当柱塞推入缸体时，泵头出口（上部）的单向阀打开，同时，流动相进入的单向阀（下部）关闭，这时就输出少量的流体。反之，当柱塞向外拉时，流动相入口的单向阀打开，出口的单向阀同时关闭，一定量的流动相就由其储液器吸入缸体中。这种泵的特点是不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的流动相。
其工作原理是：压力为
p1
的低压气体推动大面积（ SA ）活塞
A ，则在小面积（ SB ）活塞
B 输出压力增大至 p2
的液体。压力增大的倍数取决于 A 和 B
两活塞的面积比，如果 A 与 B 的面积之比为
50 : 1 ，则压力为 5 × 梯度洗提，就是载液中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。梯度洗提可以分为两种： a. 低压梯度（也叫外梯度）：在常压下，预先按一定程序将两种或多种不同极性的溶剂混合后，再用一台高压泵输入色谱柱。 b.高压梯度 ( 或称内梯度系统 ) ：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按设定的比例送入梯度混合室，混合后，进入色谱柱。
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．进样装置 (2).高压定量进样阀：与GC法用的流通法相似，能在高压下进样。
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．色谱柱 柱子内径一般为1～6 mm。常用的标准柱型是内径为 4.6 或 3.9mm ，长度为 15 ～ 30cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度 5 ～ 10μm ，柱效以理论塔板数计大约 7000 ～ 10000 。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
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．检测器 最常用的检测器，应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： a.灵敏度高：其最小检测量10-9g·mL-1，故即使对紫外光吸收很弱的物质，也可以检测； b. 线性范围宽；(比尔定律) c. 流通池可做的很小（1mm × 10mm ，容积 8μL）； d. 对流动相的流速和温度变化不敏感,可用于梯度洗脱； e. 波长可选，易于操作:如，使用装有流通池的可见紫外分光光度计（可变波长检测器）。 缺点：对紫外光完全不吸收的试样不能检测；同时溶剂的选择受到限制。 (2). 光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展；阵列由1024个光电二极管阵列，每个光电二极管宽仅50μm，各检测一窄段波长。如图所示，在检测器中，光源发出的紫外或可见光通过液相色谱流通池，在此流动相中的各个组分进行特征吸收，然后通过狭缝，进入单色其进行分光，最后由光电二极管阵列检测，得到各个组分的吸收信号。经计算机快速处理，得三维立体谱图。
(3).荧光检测器 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。
荧光检测器的结构及工作原理和荧光光度计相似。 除紫外检测器之外应用最多的检测器。
差示折光检测器是借连续测定流通池中溶液折射率的方法来测定试样浓度的检测器。溶液的折射率是纯溶剂（流动相）和纯溶质（试样）折射率乘以各物质的浓度之和。因此溶有试样的流动相和纯流动相之间折射率之差表示试样在流动相中的浓度。
第七节 高效液相色谱分离类型的选择要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围。 选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。 1、相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比较好，加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析。相对分子质量在200 ~ 2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于2000，则可用空间排阻色谱法。 2、溶解度 水溶性样品最好用离子交换色谱法和液液分配色谱法；微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离子交换色谱法；油溶性样品或相对非极性的混合物，可用液-固色谱法。 3、化学结构 若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螯合剂），可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液液分配色谱也都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可用液固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。
第八节 高效液相色谱仪应用实例气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。 据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。 1. 环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶(37 ～50mm) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm´2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。
2. 稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 ～100%甲醇；线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 ºC 柱 压：70 ´104 Pa 检测器：紫外检测器
3.阴离子分析 双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3×250mm), 流动相：0.003mol·L-1 NaHCO3 / 0.0024 mol·L-1 Na2CO3，流量138 mL/hr。 七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在3～50 ppm。
第九节 液相制备色谱色谱法最大的优势是高效分离性能，是分离分析的重要手段。前面我们学习色谱基本理论、色谱分离条件的选择，我们主要关注的是试样进入色谱柱后各组分能否分离，所用的色谱柱叫做分析型色谱柱（目的是分离，微量样品）。但是在科学研究和生产实践中，有时要求我们不仅把试样中各组分分离开，而且要获得某些组分的纯品，这就是制备色谱。所制备色谱的目的就是利用色谱分离技术获得试样中需要组分的较大量纯品，相应的色谱柱叫做制备型色谱柱。获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。
原则上，气相色谱和液相色谱都可以作为制备的手段，但液相色谱分离条件温和（试样无需气化）、分离和检测中一般不会导致试样被破坏，且易回收原物，因而受到重视。 分析型色谱柱：内径一般为1～6 mm。常用的标准柱型是内径为 4.6 或 3.9mm（长度为 15 ～ 30cm）； 制备型色谱柱：内径很大，从直径约为10mm的实验室半制备柱到直径为500mm的工业制备柱。 在什么情况下用半制备柱（内径8mm，长度15 ～ 30cm，一次制备量0.1～１mg）？在什么情况下用工业制备柱？例如，如果想知道某个组分的化学结构，而鉴定一个未知组分的化学结构，需要采用NMR、IR、MS、元素分析等手段，这是必须获得mg级的纯品（Page97,Table 3-4）；有时为了研究工作的需要，要制备几十mg甚至g级的纯品（用这种方法获得的纯品叫色谱纯）等，像这些情况，可采用直径为几十mm的半制备柱；在工业上，如果想获得大量的纯品供工业生产或商品出售，这是要用直径可大至500mm的工业制备柱。当然制备色谱一般要配大流量的高压输液泵。 本节仅对制备色谱涉及的几个问题作一简单介绍。 1.色谱柱的柱容量（柱负荷） 柱容量又叫柱负荷，对分析柱：指不影响柱效时的最大进样量；对制备柱：指不影响收集物纯度时的最大进样量。 下面以液固色谱为例来说明分析型分离柱和制备型色谱的一些差异。 分析型分离柱：进样量〈1mg/g吸附剂（固定相），严格说〈柱容量的1%，保留值（k）和柱效（H）不随进样量变化。 制备型色谱柱：进样量≥柱容量，即超载。此时，随进样量增大，柱效迅速下降，峰变宽，R减小。制备型色谱柱允许超载，超载可提高制备效率，但以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。 2. 液相制备色谱的方法 液相制备色谱可能出现图3-26所示的几种典型情况。 a. 欲分离组分呈一个峰； b. 两个或多个主组分； c. 较少的组分是欲分离制备的化合物； 对于第一种情况（图3-26a），可按图3-27所示的方法处理。①.首先在分析型HPLC上进行试验（图3-27a），选择出最佳的分离条件，亦即获得最大的R值（图3-27b）；②. 增加进样量，直至峰刚好开始重叠（图3-27c），此进样量即为柱子的最大负荷；③.如果需要的纯品 的量不是很大，可以将柱径及最大进样量（最大负荷）按比例扩大，同时，扩大输液泵流量，即成为制备色谱。其分离方式同图3-27c；如果需要更大量的纯品，可使柱子超载运行，此时峰出现部分重叠，用中心切割法收集部分馏分，用薄层色谱检验纯度，多次制备合并馏分。 对于第三种情况（图3-26c），较少的组分是欲分离制备的化合物，即欲分离的物质是试样中的微量或痕量组分，使用的制备方法如图3-28所示。①. 可用前述方法达到最佳分离度后，利用超载进行富集（图3-28b）, 多次制备富集合并馏分；②. 富集后的馏分，欲分离的组分成了主组分，可再次按第一种情况（图3-26a）处理（分离制备）。 例1．See Fig.3-29.
3. 制备型液相色谱仪 典型的制备型液相色谱仪的结构及流路如图3-30所示。：结构与分析型一样，但泵流量大（20～100mL/min）、进样量大、采用制备柱（内径20～50mm，柱长50cm）；在检测器后增加自动馏分收集器。
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Pa 
